VIKING法

Welcome to the VIKING method

Easy and fast knock-in for any cell line!

・English page is here

VIKING(Versatile non-homologous end joining-based knock-in module for genome editing)法は,
遺伝子導入可能な細胞において,簡便に高効率なノックインを実現する技術です.

VIKING法は,NHEJ修復を利用したノックイン技術を下記の2点で改良したものです.
1.ドナーベクター,ゲノム編集ベクターの導入する比率を最適化(75%の細胞でランダムな挿入なしのノックイン)
2.VKG1配列を用いるので,既存ベクターを全く改変せずにドナーベクターとして利用可能

※ pUC, pBluescript II (+), pcDNA3, pENTR ... などの標準ベクターはVKG1配列を含んでいるため,ノックインに利用できます.



・プラスミドのリクエスト(国内Addgene
"Development of versatile non-homologous end joining-based knock-in module for genome editing"
Shun Sawatsubashi, Yudai Joko, Seiji Fukumoto, Toshio Matsumoto, Shigeo S. Sugano
Scientific Reports, 2018 

"Protocol for CRISPR/Cas9-based knock-in using the VIKING method"
Yudai Joko, Shigeo S. Sugano, Seiji Fukumoto, Toshio MatsumotoShun Sawatsubashi
Protocol Exchange, 2019  

・ 培養細胞における簡便案ノックインを可能とするゲノム編集法:VIKING法 2019年7月号(Vol.37 No.11)「実験医学」



図:VIKING法の概要


動作原理①:NHEJ修復を利用したノックイン
VIKING法は,非相同末端結合(non homologous end joining, NHEJ)修復を利用したノックイン技術(ObLiGaReなど1-2)を利用しています.一般的に,細胞の中でゲノムDNAに切断が生じた場合,NHEJ修復または相同組換え(homologous recombination, HR) 修復が起こりますが,NHEJ修復はHR修復に比べて高頻度でおこるDNA修復経路です3.今まで,ノックイン技術にはHR修復が利用されてきました.HR修復が低頻度でしか起こらないために,今までの手段でノックインが成立した細胞を取得するには,多数の細胞へドナーベクターを導入し,わずかに存在するノックイン細胞を選抜する必要がありました.NHEJ修復を利用した場合,HR修復よりはるかに高頻度でおこるため,ノックインの成立も高頻度で起こると考えられています1-2.そのため,VIKING法では,三つのベクター(ドナーベクター(A),ドナー切断用ベクター(B),ターゲット切断ベクター(C))を同時に細胞に導入します.三つのベクターを導入すると,まず,ドナー切断用ベクターから生じる人工DNA切断酵素が,細胞内でドナーベクターを切断します(図:緑色のハサミ).さらに,ターゲット切断ベクターがゲノムの狙った位置を切断します(図:青色のハサミ).切断されたドナーベクターの末端と,ゲノムの断片の末端が,NHEJ修復により結合して,ノックインが起こります.ノックインが起こらなかった染色体では,一定確率でフレームシフトの誘導によるノックアウトが起こります(図:indelによるノックアウト).これらの技術は,Maresca博士ら(TALENの利用)あるいはCristea博士ら(ZFNの利用)により,2012年に提案されており1-2,活用も進んできています.私たちは,彼らの技術に大きな敬意と感謝をもっています.


動作原理②:VIKING法の強み
VIKING法では,ドナーの切断のために「VKG1配列」という配列の利用を提案しています(図:緑「×」部).VKG1配列はさまざまなベクターに存在しているので,VKG1配列を持つベクターをドナーとして利用する限り,ドナーベクターとドナー切断用ベクターのいずれも改変する必要がありません(図:VIKING汎用モジュール).VIKING法では,さらに,NHEJ修復依存的ノックインのためのベクター導入条件を最適化しました.論文では,ランダムな挿入ができるだけ少なく,ノックイン効率が高い条件を示しています.NHEJ修復依存的ノックインは既に多くの報告がなされており,最適化も進んでいます4-10改良版であるVIKING法も,幅広い細胞種,生物種にも適用可能であると考えています.


動作確認済みの細胞(2018年1月現在)
  • HaCaT (human, aneuploid keratinocyte cell line)
  • HEK293F (human, embryonic kidney cells)
  • C4-2 (human, prostate cancer cell line)
  • UMR-106 (rat, osteogenic cell line)

特許情報
VIKING法に関する特許を徳島大学から出願済みです.
産業利用にご興味ある場合は,shun-sawa2 at tokushima-u.ac.jp(at を@としてください)までご連絡ください.
アカデミアで実施される研究へのご利用には,制限はありません.


研究体制
沢津橋俊(徳島大学)shun-sawa2 at tokushima-u.ac.jp
菅野茂夫(産業技術総合研究所)shigeo.sugano at aist.go.jp
atを@としてください.


Related studies:
1. Maresca et al. Obligate ligation-gated recombination (ObLiGaRe): custom-designed nuclease-mediated targeted integration through nonhomologous end joining. Genome Res 23, 539-546 (2013).  
2.  Cristea et al. In vivo cleavage of transgene donors promotes nuclease-mediated targeted integration. Biotechnol Bioeng 110, 871-880 (2013). 
3.  Haber "Genome stability" 2013. Garland Science
4.  Auer et al. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Res 24, 142-153 (2014). 
5.  Lackner et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nat Commun 6, 10237 (2015). 
6.  Kimura et al. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Sci Rep 4, 6545 (2014). 
7.  Schmid-Burgk et al. CRISPaint allows modular base-specific gene tagging using a ligase-4-dependent mechanism. Nat Commun 7, 12338 (2016). 
8.  Li et al. Gene replacements and insertions in rice by intron targeting using CRISPR-Cas9. Nat Plants 2, 16139 (2016). 
9.  Katoh et al. Practical method for targeted disruption of cilia-related genes by using CRISPR/Cas9-mediated, homology-independent knock-in system. Mol Biol Cell 28, 538 898906 (2017). 
10. Tálas et al. A convenient method to pre-screen candidate guide RNAs for CRISPR/Cas9 gene editing by NHEJ-mediated integration of a 'self-cleaving' GFP-expression plasmid. DNA Res 24, 609621 (2017).